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Source text - English The proposed work involves structural explorations of observed complexes of the plasmid and bacterial chromosomal gene products that together are responsible for plasmid replication and mobilization of plasmids pMV158 of S. agalactiae and R388 of E. coli. Other systems may be included in the project as the work progresses, if deemed useful or necessary. The final goal of the project is to formulate a comprehensive structural mechanism of plasmid replication and mobilization that encompasses all the steps in the functional pathways. Thus, the practical approach will involve the preparation of the different complexes between DNA and gene product components by reconstitution, starting from the individual proteins, DNA fragments and RNA molecules. My experience in the plasmid replication research is exemplified by recent publications on the subject in international, leading peer-reviewed journals and a book chapter.
Preferably, complexes that represent intermediates of the mechanisms under study will be subjected to crystallization procedures and subsequent X-ray crystallography analyses. However, the sample properties of the multicomponent complexes, like lack of homogeneity and inherent flexibility, may implicate that other techniques, different from X-ray diffraction (XRD) analysis, are more suitable for achieving the goal of the project. Therefore, an approach will be used that takes advantage of the fact that other structural biology techniques allow the study of flexible systems in different states, e.g. in solution. I have previously used and plan to continue to routinely apply electron microscopy (EM) and small angle scattering using X-ray and neutron radiation (SAXS/SANS) in subsequent studies. Because integration of results from different structural biology techniques is at its infancy, this proposal includes the development of methods that will allow the use of structures of one technique into the other, as well as the integration of the information of all techniques for the elucidation of the biological question at hand. I will briefly outline the work plan I intend to pursue in the two research lines that constitute this proposal, i.e. the ‘methodological’ and ‘biological’ line.
EM and SAS are complementary rather than equivalent to XRD, which is a result of the different environments in which the systems are studied. As a result, EM and SAS on a flexible system will lead to models that are different from models obtained by XRD analysis of that same system; the latter technique reveals local flexibility with respect to a rigid well-defined scaffold (e.g. domain movement relative to a tightly interacting structural core), whereas EM and SAS models represent an averaged conformation over the full size of the particle (provided that one can study a single, immutable (multi)molecular species). The implication of this is that XRD allows a detailed description of a single still image of a complex in an invariable state, whereas solution techniques give information on the dynamics of the system, at the expense of resolution and structural detail. The reconciliation of the structures from different techniques, both from a technical point of view as well as in the biological interpretation, is no foregone matter. For example, it was proven difficult to resolve a high-resolution XRD structure through molecular replacement from an EM reconstruction. Furthermore, comparison of XRD structures with SAS structures can be severely hampered due to the difference in diffraction resolution and complex flexibility between both techniques. I intend to develop methods that will allow the integrated interpretation of the methods and mutual use of results from various techniques. The primary focus will be on the application of modulations on low-resolution EM maps in an attempt to bridge the resolution gaps between EM and XRD by theoretical means. The advantages of this approach will be several. For example, it will improve the rate of success of molecular replacement techniques that use EM maps of flexible systems for XRD macromolecular phasing. In addition, it will allow the analysis of particle flexibility on a global level, revealing the movement of large structurally invariant substructures within the complex. To achieve this, a method of local density modulation will be applied, which is based on the calculation of normal mode harmonics within density maps. The resulting eigenfrequencies will then be used to vary the density in a consistent and physically meaningful manner. The underlying mathematical model can be changed, replacing normal mode analysis with e.g. the principle of communicating vessels in order to model density flows through space.
In addition, global density modulations will be applied in order to account for the different ways that molecular flexibility manifests itself in density maps. Thus, in EM maps, electron density aggregates locally in regions that correspond to the equilibrium positions of moving and oscillating structural elements (e.g. domains) and tends to diminish in between these focal points. A correction for this phenomenon will need to be applied before the maps can be used for XRD phasing. Histogram matching has proven to be a valuable tool in density modification in XRD high resolution phasing. Similarly, it is expected to be a satisfactory means of redistributing the EM density in order to compensate for flexibility-dependent electron density localization. As calibration models, calculated low-resolution maps of actual XRD structures will be used, which represent the desired density distributions. During the calibration step, it may be necessary to impose modelled flexibility onto the XRD structures in order to remove atomic detail in the density maps. This can be achieved through TLS simulations of the atomic coordinates, implemented in current refinement programs for macromolecular crystallography. The density of real EM maps will then be readjusted so that their density histograms match those of the calibration histogram.
Biology of plasmid replication and mobilization: work plan
The primary focus will be on the pMV158 plasmid and its gene products. pMV158 is a relatively small (5541 bp, 6 gene products) plasmid and the related replication and mobilization processes are therefore expected to be less complicated than those of the R388 plasmid (33913 bp, ~40 gene products). The research will be mainly concerned with the structural elucidation of complexes involved in the pMV158 replication and mobilization pathway. The R388 plasmid will be the focus of later work although occasional studies related to this plasmid may be conducted from the start of the project. In addition, other plasmids may prove to provide valuable additions to the proposed project goal and may be included in later stages. I plan to perform the following tasks:
1) Prepare complexes of the molecular components involved in plasmid replication and mobilization and evaluate the formation, stability and biochemical properties of the resulting multicomponent complexes. To name some of the complexes that will be prepared: the replication initiator RepB in complex with its cognate DNA fragments (bind and nic regions), RepB in complex with the nic region and/or the helicase PcrA from S. agalactiae, the protein MobM (responsible for transfer initiation) in complex with its cognate DNA fragment (oriT). The analyses will require extensive use of biochemical characterization methods, including chromatography, spectroscopy, SDS PAGE and native gel preparations, DLS and ultracentrifugal analysis. I have ample experience in all of these methods from earlier work on protein purification and complex preparations in the projects undertaken in the post-doc periods at the CQFB, working on the isoquinoline oxidoreductase (IOR), and at the IBMB-CSIC. I have a proven track record in the preparation of protein-DNA complexes, protein purification and the characterization of biological samples.
2) Subject individual components and suitable complexes to crystallization experiments using extensive screening and crystal growth tracking techniques. The institute where I’m currently working has an automated platform for crystallization and diffraction experiments at its disposal; equipped with state-of-the-art high-throughput XRD equipment (i.e. an automated sample changer allowing high-throughput crystallography and a free-mounting system allowing controlled (de)hydration of crystals). I have studied and practised chemical and macromolecular crystallography for over 10 years and deposited crystal structures in both the Cambridge Structural Database and Protein DataBank. I have extensive experience in the preparation of crystals and in conducting and processing diffraction experiments both on in-house (rotating-)anode sources as well as on large-scale facilities such as the synchrotron radiation source in Grenoble (ESRF).
3) Complexes that will be amenable to crystallization and diffraction will have their structures be determined by XRD. Selenomethionine preparations will be used and where necessary, other crystallographic phasing techniques (e.g. heavy atom soaks, introducing modified DNA fragments) will be applied. Using structures of individual components of the pMV158 gene products that are available at this point, phasing through molecular replacement is viable. Where structures of individual components are not available (e.g. MobM), structure determination will be included in the work plan. I have a proven track record in molecular replacement and experimental phasing techniques and have applied these methods successfully in recent science projects. I have used many of the available software packages used for phasing structures (including the SHELX suite of programs, SOLVE/RESOLVE, SHARP, DM/DMMULTI, pirate/buccaneer) and refinement packages (SHELX, refmac5, CNS).
4) Complex preparations that are considered suitable for EM and SAS will be studied by those techniques. For SAS, we have access to both the ESRF (Grenoble, France) as well as DESY (Hamburg, Germany). EM measurements will be performed through collaborations.
5) Interpret and integrate the structural data and biochemical results into an encompassing model with the aim to depict the structural pathway of plasmid replication and mobilization on an atomic level. This is not considered to be the closing stage of the project but rather is a continuous readjustment of the understanding of the subject and all experimental results obtained during the work. Simultaneously, methods will be developed that will allow the integrated interpretation of the results from the various techniques that were applied as described above.
In conclusion, the project requires skills in biochemistry, XRD, EM, SAS and the interpretation of structural information, with emphasis on complex preparation, crystallization and structure determination. In my opinion, my experience fits the profile required for the project proposal. Through the peer-reviewed international research papers I am (co-)author of, I can demonstrate that I was actively involved in the preparation, purification and structural biology techniques required for this project.
Translation - Spanish El presente proyecto se centra en las exploraciones estructurales de complejos observados de los productos genéticos de los plásmidos y el genoma bacteriano, que en conjunto son responsables de la replicación y la movilización de los plásmidos pMV158 de S. agalactiae y R388 de E. coli. Otros sistemas podrán ser incluidos con el progreso del trabajo cuando se considere oportuno o necesario. Se pretende formular un mecanismo estructural comprensivo de la replicación y movilización plasmídica que comprenda todos los pasos de las rutas funcionales. Así, el enfoque práctico implicará la preparación de los diferentes complejos entre el ADN y los productos genéticos por reconstitución a partir de las proteínas individuales y los fragmentos de ADN y ARN. Mi experiencia en la investigación de la replicación plasmídica queda demostrada por publicaciones recientes sobre el tema en revistas internacionales y la publicación de un capítulo de un libro.
Los complejos representantes de intermediarios de los mecanismos estudiados se someterán preferiblemente a procedimientos de cristalización y posterior análisis por difracción de rayos X (XRD). Sin embargo, las propiedades de las muestras de los complejos que consisten en múltiples componentes, tal como la falta de homogeneidad y la flexibilidad inherente, pueden indicar que otras técnicas diferentes al XRD sean más adecuadas para lograr las finalidades establecidas en esta propuesta. Por consiguiente, se plantea usar un método de trabajo que aprovecha el hecho que otras técnicas de biología estructural permiten estudiar los sistemas flexibles en diferentes estados, p.ej. en solución. He usado las técnicas de microscopia electrónica (EM) y dispersión a bajo ángulo (SAS) previamente y tengo la intención de continuar aplicando estas técnicas de forma rutinaria en los estudios posteriores. Porque la integración de los resultados de diferentes técnicas de la biología estructural está en su infancia, esta propuesta incluye el desarrollo de métodos que permitirán el uso de las estructuras procedentes de una de estas técnicas en otra, tanto como la integración de la información de todas ellas para resolver el problema biológico que se esté tratando. Abajo, esbozaré brevemente el plan de trabajo que pretendo seguir en las dos líneas de investigación en que consiste esta propuesta, o sea la línea 'metodológica' y la línea 'biológica'.
Desarrollo de métodos: llenar el vacío entre técnicas de la biología estructural
EM y SAS son técnicas complementarias más que equivalentes a la técnica de XRD, lo cual es el resultado del cambio de entorno en que se llevan a cabo los estudios correspondientes. Como consecuencia, la aplicación de EM y SAS a sistemas flexibles producirá modelos diferentes a los modelos obtenidos por un análisis por XRD del mismo sistema; XRD muestra flexibilidad local respecto a una parte rígida y bien definida (p.ej. el movimiento de un dominio relativo a un núcleo estructural formado por interacciones fuertes), mientras que modelos de EM y SAS representan conformaciones mediadas de la partícula entera (con la condición que uno pueda estudiar una especie multimolecular única y inmutable). La implicación consiguiente es que XRD permite determinar con detalle una imagen 'parada' de un complejo en un estado invariable, mientras que las técnicas en solución dan información sobre la dinámica del sistema, en detrimento de resolución y detalle estructural. La reconciliación de las diferentes técnicas, tanto desde el punto de vista técnico como de la interpretación biológica, no es un problema resuelto. Por ejemplo, resulta difícil resolver una estructura XRD a alta resolución por reemplazo molecular usando una envolvente procedente de EM a baja resolución. Además, la comparación de estructuras XRD y SAS puede hacerse más difícil por la diferencia en la resolución de difracción y la flexibilidad de un complejo entre las dos técnicas. Pretendo desarrollar métodos que permitirán la interpretación integrada y el uso mutuo de los resultados de las diferentes técnicas. El enfoque primario consistirá en aplicar modulaciones a los mapas a baja resolución procedentes de EM en un intento de acercar el límite inferior de la resolución de EM al límite superior de XRD por medios teóricos. Las ventajas consiguientes serán varias. Por ejemplo, se mejorará el índice de éxito de las técnicas de reemplazo molecular a partir de los mapas de sistemas flexibles de EM en el faseado de XRD. Además, se permitirá el análisis de la flexibilidad de las partículas a un nivel global, revelando el movimiento de subestructuras grandes e invariables dentro del complejo. Para lograrlo, se aplicará una modulación de la densidad local, el cual se basará en cálculos de los movimientos harmónicos por modos normales dentro de los mapas de densidad. Como paso siguiente, las eigenfrecuencias serán usadas para variar la densidad de forma consistente y relevante físicamente. Se puede cambiar el modelo matemático, remplazando el análisis por modos normales por p.ej. el principio de los vasos comunicantes para modelar el flujo de densidad por el espacio.
También se aplicarán modulaciones globales a la densidad para simular las varias maneras en que la flexibilidad se manifiesta en los mapas de densidad. Así, la densidad está concentrada localmente en ciertas regiones de los mapas de EM, los cuales corresponden a las posiciones de equilibrio de los elementos estructurales móviles y oscilantes (p.ej. los dominios) y tiende a disminuir entre medio de estos puntos. Una corrección para este fenómeno será aplicada necesariamente antes de que se puedan usar estos mapas para el faseado en XRD. El ajuste de la densidad mediante el uso de los histogramas ha demostrado ser una herramienta valiosa en la modificación de la densidad en el faseado en XRD. Similarmente, se espera que este método sea un medio satisfactorio para la redistribución de la densidad de EM para compensar por la acumulación de densidad electrónica causada por la flexibilidad. Como modelos de calibración, se usarán mapas calculados a baja resolución procedentes de estructuras reales de XRD, los cuales representarán las distribuciones de densidad deseadas. Durante el paso de calibración, puede ser necesario imponer una flexibilidad modelada a las estructuras XRD para borrar detalles atómicos en los mapas de densidad. Esto se puede lograr mediante simulaciones TLS aplicadas a los coordinados atómicos, implementadas en los programas actuales de refinamiento para la cristalografía macromolecular. La densidad real de los mapas de EM será posteriormente ajustada para que sus histogramas de densidad se parezcan a los histogramas calibrados.
Biología de la replicación plasmídica y su movilización: plan de trabajo
El enfoque primario será en el plásmido pMV158 y sus productos genéticos. pMV158 es un plásmido relativamente pequeño (5541 pares de bases, seis productos genéticos) y, por tanto, se espera que los procesos de la replicación y movilización sean menos complicados. El trabajo del proyecto se centrará primeramente en resolver las estructuras de los complejos involucrados en las rutas de replicación y movilización de este plásmido. El plásmido R388 será estudiado posteriormente aunque estudios ocasionales relacionados en este plásmido se puedan realizar desde el inicio del proyecto. Además, otros plásmidos podrán constituir adiciones valiosas para las finalidades de este proyecto y podrán ser incluidos más adelante. Mi intención es llevar a cabo las siguientes tareas:
1) Preparar los complejos de los componentes moleculares involucrados en la replicación y movilización y evaluar la formación, la estabilidad y las propiedades bioquímicas de los complejos multicomponentes resultantes. Algunos de los complejos que serán preparados son: el complejo de la iniciadora de la replicación RepB con los fragmentos del ADN de reconocimiento (las regiones bind y nic), el complejo de la RepB y la región nic del ADN y/o la helicasa PcrA de S. agalactiae, el complejo de la proteína MobM (responsable de la iniciación de movilización) y el fragmento del ADN de reconocimiento (oriT). Los análisis exigen un uso extensivo de los métodos de caracterización bioquímica que incluyen la cromatografía, la espectroscopia, los geles SDS PAGE y nativos, DLS y análisis mediante ultracentrifugación analítica. Tengo una amplia experiencia con estas técnicas debido a proyectos anteriores del CQFB y del IBMB-CSIC. Además, tengo una experiencia probada en la preparación de complejos de proteína y ADN, su purificación y la posterior caracterización de las muestras.
2) Someter los componentes individuales y los complejos apropiados a experimentos de cristalización usando cribajes extensos y los robots de seguimiento de la cristalización. Una plataforma automatizada de cristalización y difracción está disponible en el instituto donde trabajo ahora, la cual tiene un robot de dispensión de líquidos para la preparación de cribajes de cristalización ‘high-throughput’ y un robot para el almacenamiento de las placas de cristalización y el seguimiento del crecimiento de los cristales. Además, los miembros del instituto tienen acceso a dos generadores de rayos X que están dotados con equipamiento de difracción de vanguardia (p.ej. un intercambiador automático de cristales y un sistema de ajuste de la hidratación de cristales a temperatura ambiente). He estudiado y practicado la cristalografía química y macromolecular durante diez años y he depositado estructuras cristalográficas en el ‘Cambridge Structural Database’ (CSD) y el 'Protein Databank Brookhaven'. Tengo una amplia experiencia en la preparación de cristales y en la realización y el procesamiento de los experimentos de difracción, usando tanto los generadores disponibles en el instituto como los equipos de gran escala tales como el sincrotrón en Grenoble (Francia).
3) Complejos que puedan ser cristalizados y que muestren difracción adecuada serán resueltos por XRD. Para este fin, se usarán preparaciones de proteínas que contienen selenio-metionina y, donde fuera necesario, se usarán otras técnicas de faseado cristalográfico (p.ej. incubación con átomos pesados, uso de fragmentos de ADN modificados). Usando estructuras de componentes individuales de los productos genéticos del pMV158 disponibles en este momento, el faseado por reemplazo molecular es posible. Donde no estén disponibles, se incluirá su resolución estructural en el plan de trabajo. Tengo experiencia probada en reemplazo molecular y técnicas de faseado cristalográfico experimental y he aplicado estos métodos con éxito en proyectos recientes. He usado muchos de los programas para el faseado de estructuras (p.ej. los programas SHELX, SOLVE/RESOLVE, SHARP, DM/DMMULTI, pirate/buccaneer) y los programas de refinamiento (SHELX, refmac5, CNS).
4) Muestras de complejos que se consideren adecuadas para EM y SAS serán estudiadas por estas técnicas. Para hacer SAS, se puede acceder tanto al ESRF (Grenoble, Francia) como a DESY (Hamburgo, Alemania). Experimentos EM se llevarán a cabo a través de colaboraciones.
5) Interpretar e integrar los resultados experimentales en un modelo integral con el fin de proporcionar una representación de la ruta estructural de la replicación y movilización plasmídica a nivel atómico. Esta tarea no está considerada como la última fase del proyecto, sino como un ajuste continuado del entendimiento del tema y de todos los datos experimentales. Simultáneamente, se pretende llevar a cabo el desarrollo de métodos que permitirán la interpretación integrada de los resultados de diferentes técnicas que han sido aplicadas en los pasos anteriores.
En resumen, el proyecto exige habilidades en bioquímica, XRD, EM, SAS y en la interpretación de la información estructural, con énfasis en la preparación de los complejos y su posterior cristalización y análisis cristalográfico. En mi opinión, mi experiencia se ajusta al perfil deseado para llevar a cabo el presente proyecto. Por ser (co-) autor de artículos publicados en revistas internacionales puedo demostrar que he estado activamente involucrado en las técnicas de preparación, purificación y las técnicas de biología estructural necesarias para el proyecto aquí presentado.
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Scientific abstracts, English to Spanish and English to Dutch
Expediente de daños, Dutch to Spanish Selection of research papers: Boer Ret al. (2006). "Unveiling the molecular mechanism of a conjugative relaxase: The structure of TrwC complexed with a 27-mer DNA comprising the recognition hairpin and the cleavage site", J. Mol. Biol.358, 857-69. Boer DR, et al. (2004). "X-ray crystal structure and EPR spectra of "arsenite-inhibited" Desulfovibriogigas aldehyde dehydrogenase: a member of the xanthine oxidase family", J. Am. Chem. Soc.126, 8614-5.
About me / Sobre mi / Over mezelf
I'm Dutch and have an academic background in chemistry, structural chemistry and drug design. I have 7 years of post-doc experience in the field of structural biology, biochemistry and molecular biology, working in Portugal and Spain. I have studied English for over 20 years and Spanish for ten years. My field of expertise comprises the life sciences and includes physics. Also, I am able to translate more general technical texts in any direction between Dutch, English and Spanish. From March 2008, I started translating professionally.
Tengo la nacionalidad holandesa con formación académica en el campo de la química estructural y el diseño de fármacos. Tengo siete años de experiencia como pós-doc en el campo de la biología estructural, la bioquímica y la biología molecular, trabajando en Portugal y España. He estudiado el inglés desde hace 20 años y el castellano desde hace diez años. Mi área de especialización incluye las ciencias de la vida y la física. También me veo capaz de traducir textos técnicos más generales entre el holandés, el inglés y el castellano. Desde marzo de 2008, empezé a traducir profesionalmente.
Ik ben ben Nederlander en heb een academische acthergrond in de structuurchemie en medicijnontwikkeling. Ik heb 7 jaar ervaring als post-doc in de structuurbiologie, biochemie en moleculaire biologie en heb in Portugal en Spanje gewerkt. Ik studeer sinds 20 jaar Engels en sinds 10 jaar Spaans. Mijn expertisegebied behelst zodoende de levenswetenschappen en de natuurkunde. Daarnaast acht ik mij in staat om ook meer algemene technische documenten te kunnen vertalen van en naar het Nederlands, het Engels en het Spaans. Sinds maart 2008 ben ik begonnen als professioneel vertaler.
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